祈灵工具箱🔬朗伯-比尔定律计算器 - 标准曲线拟合、未知样浓度、检出限
朗伯-比尔定律 A = ε·b·c 指出：单色光通过稀溶液时，吸光度 A 与摩尔吸光系数 ε（L·mol⁻¹·cm⁻¹）、光程 b（cm）和浓度 c（mol/L）成正比，吸光度与透光率的关系是 A = −lg T = 2 − lg(%T)。例如 NADH 在 340 nm 的 ε = 6220，1 cm 比色皿测得 A = 0.622，则 c = 0.622 ÷ 6220 = 1.00 × 10⁻⁴ mol/L = 100 μM。实际分析中更常用标准曲线（工作曲线）：配制 0、2、4、6、8 mg/L 的标准溶液，测得吸光度 0.002、0.151、0.298、0.452、0.598，最小二乘拟合得 A = 0.07465c + 0.0016，R² = 0.99995。本工具可在表格中直接编辑或从 Excel/CSV 粘贴标准点，可勾选排除异常点或强制过原点，给出斜率和截距的标准误差、残差、残差标准差 s(y/x)，并按 ICH 方法计算检出限 LOD = 3.3s/斜率、定量限 LOQ = 10s/斜率；多个未知样可输入平行测定值和稀释倍数，按标准公式算出浓度的标准偏差 s(x₀) 和 95% 置信区间，超出标准范围时给出外推提示。另有 A = εbc 任意求一个量（浓度支持 M、mM、μM 和 mg/L，mg/L 可直接输入化学式求摩尔质量）、由储备液配制系列标准溶液的移液量表，以及偏离比尔定律的原因说明。预设 KMnO₄ 525 nm、Fe²⁺–邻二氮菲 510 nm、Bradford 蛋白测定和 NADH 340 nm 示例。
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如何使用比尔-朗伯定律与标准曲线
- 1选择预设或浓度单位，在表格中输入标准溶液浓度和吸光度（也可从 Excel 粘贴两列）
- 2查看回归方程、R²、残差和标准曲线图，在未知样表格中填写吸光度和稀释倍数得到浓度与置信区间
- 3需要时切换到 A = εbc 计算或标准溶液配制，最后导出 CSV 数据和 PNG/SVG 曲线图
常见问题
- 朗伯-比尔定律的公式是什么，各量单位是什么？
- A = ε·b·c。A 是吸光度（无单位），ε 是摩尔吸光系数，单位 L·mol⁻¹·cm⁻¹；b 是光程（比色皿厚度），单位 cm；c 是物质的量浓度，单位 mol/L。若浓度用 mg/L，需要除以 1000 和摩尔质量换算成 mol/L。吸光度与透光率的关系是 A = −lg T = 2 − lg(%T)，A = 1 表示只有 10% 的光透过。
- 怎样用标准曲线求未知样浓度？
- 用 4～6 个已知浓度的标准溶液测吸光度，以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标做线性回归得到 A = a·c + b；在同样条件下测未知样吸光度，代入 c = (A − b)/a。如果样品测前稀释过，再乘以稀释倍数。工具还按 s(x₀) = s(y/x)/|a|·√(1/m + 1/n + (Ā − ȳ)²/(a²Sxx)) 给出浓度的不确定度和 95% 置信区间。
- R² 多大才算合格？要不要强制过原点？
- 分光光度法的标准曲线一般要求 R² ≥ 0.999（r ≥ 0.9995），具体以所在实验室或标准方法的要求为准。R² 高并不代表没有系统偏差，还应看残差是否随浓度呈弯曲趋势。只有在已扣除试剂空白、截距与零无显著差异时才考虑强制过原点，否则会引入偏差，通常保留截距更稳妥。
- 为什么高浓度时标准曲线会弯曲？
- 朗伯-比尔定律只在稀溶液、单色光条件下严格成立。吸光度超过约 1.0～1.5 时透过光很少，杂散光影响显著；狭缝过宽（非单色光）、溶液中的解离或缔合平衡、浓度高于约 0.01 mol/L 时的分子间作用以及浑浊散射都会使曲线偏离直线。应把吸光度控制在约 0.1～1.0，超出时稀释样品后再测。