🔬显微镜分辨率计算器 - 阿贝极限、数值孔径、有效放大率、奈奎斯特采样

如何使用显微镜分辨率与成像计算器

1. 1选择物镜（干物镜、水浸或油浸）和波长，查看各种判据下的分辨率
2. 2拖动两个点光源的间距，看艾里斑何时合成一个
3. 3在放大率、相机采样和景深页面选择目镜、视场数、相机像素和适配镜，检查是否空放大、是否欠采样
4. 4在照明与衬度、超越衍射极限页面比较不同衬度方式和超分辨技术

常见问题

光学显微镜最多能看清多小的东西？

受衍射限制，横向分辨率约为 d = 0.61λ/NA（瑞利判据）。绿光 550 nm、最好的油浸物镜 NA 1.4 时 d ≈ 240 nm，阿贝极限 λ/2NA ≈ 200 nm。所以普通光镜能看清细菌和线粒体的轮廓，但看不清病毒的形状，单个病毒最多是一个模糊光点。

为什么放大倍数调得再高也看不到更多细节？

细节由物镜的 NA 决定，目镜和数码放大只是把已经形成的像放大。一般认为有效放大率在 500×NA 到 1000×NA 之间，比如 NA 0.65 的 40× 物镜配 10× 目镜是 400×，合适；再用 25× 目镜到 1000× 就超过了 650×，属于“空放大”，图像更大但更糊。

油浸物镜为什么能提高分辨率？

NA = n·sinθ。干物镜里样品发出的光要经过空气，n = 1，即使收光角接近 72°，NA 也只能到 0.95 左右；大角度的光还会在盖玻片表面全反射损失掉。在盖玻片和物镜之间滴上折射率 1.518 的浸油，n 变大、全反射消失，NA 可以达到 1.4 以上，分辨率提高约 1.5 倍。

显微镜接相机时像素应该多大？

按奈奎斯特采样，样品面上每个分辨单元至少要有 2 个（通常取 2.3）像素。样品面像素 = 相机像素 ÷ (物镜倍数 × 适配镜倍数)。例如 6.5 µm 像素配 60×/1.4 物镜、1× 适配镜，样品面像素 108 nm，荧光 520 nm 的分辨率约 227 nm，比值约 2.1，正好；如果用 0.5× 适配镜就欠采样了。

超分辨显微镜是怎么突破衍射极限的？

它们并没有让光斑变小，而是利用荧光分子的开关特性。STED 用环形耗尽光把光斑边缘的荧光关掉，分辨率 d = λ/(2NA√(1+I/Is))；STORM、PALM 让分子一次只亮少数几个，再用光子统计把每个分子定位到几纳米到几十纳米；SIM 用条纹照明把高频信息“搬”进来，提高约 2 倍。电子显微镜则直接用皮米级的电子波长，实际受透镜像差限制在约 0.1 nm。